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HBV基因定量分析技术的应用价值、存在问题及展望--HBV基因定量分析技术的应用价值(2)
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| 文章出处：中国论文下载中心 发布时间：2005-11-11 |
㈣前核基因突变HBV定量意义
HBV前核基因突变可导致HBeAg表达缺失。感染不表达HBeAg的HBV突变株，或野生型HBV在体内突变并成为优势株均产生较严重的后果，如易发生暴发性肝炎，预后差，干扰素治疗无效等[9,10]。目前已能采用核酸序列测定技术、PCR技术、限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术等来定性检测HBV前核基因突变。最近Baxall建立了一种PCR及产物的显色反应点突变分析技术(Colourimetric point mutation assay)，用来定量分析突变前核基因，有助于进一步探讨HBV突变与致病性之间的关系[11]。
基因定量分析是一项临床应用型技术，但对基础研究也有一定的应用价值[12]，尤其是在当前基因治疗、转基因动物、核酸疫苗等热点研究领域，基因定量分析可能是一种很好的辅助手段，对发现一些有意义的现象也许有一定帮助。比如HBV在转基因小鼠组织脏器分布规律可用定量标准来衡量，以及用定量手段观察各种药物、细胞因子和其它物质对转基因小鼠HBV基因复制的调节作用。又如对核酸疫苗注入肌组织后的各种动力学变化的研究远未深入，如能采用定量手段，分析抗原表达基因在体内的存在状态无疑是有益的。至于各种抗HBV药物，无论是在体外细胞模型(包括转基因细胞模型)还是在动物模型的研究，或在人体研究，采用基因定量分析，应当是考核药物疗效的最佳手段[13]。
HBV因定量分析存在的问题及未来展望
HBV基因定量技术的发展历史不长，但由于有定性技术为基础，以及与其它学科方法的融汇，发展速度很快，目前趋于成熟。但应用定量技术去研究HBV感染的临床问题还不充分，同时定量技术本身也有许多问题值得探讨。
一、国际标准化。这是一个最为突出而又必须尽快解决的问题。欧洲有一个“病毒性肝炎研究组”（European Study Group in Viral Hepatitis)，经常向欧洲的某些研究机构提供HBV血浆标准品作定量分析参考[14]。有必要在国际上设立统一的HBV基因标准品，包括各种HBV亚型的标准参照。笔者认为，克隆的HBV DNA质粒不适宜作标准品。克隆HBV DNA与载体构成了闭环超螺旋结构，而且，一级结构单一，这与体内存在的HBV基因结构差异很大。后者呈部分双链，在血清中尚有裂解片段及复制中间体等形式。因此，无论是在分子杂交，还是在PCR过程中，质粒HBV DNA结构与人体内感染的HBV DNA结构在杂交效率或扩增效率上必然有细微差别，结果将影响定量分析的准确性。如从高水平HBV阳性病人血清大量抽提，或从转基动物血液中纯化得到HBV DNA，可能是一个制备标准品的途径。总之，国际化的标准参照，是保证HBV DNA定量技术精确性和可靠性的前提。
二、分子杂交定量技术和PCR定量技术应当共存下去吗? 以下两点值得考虑:首先，有必要弄清体内HBV复制水平极低者(如低于1fg/ml)占HBV感染人数的比例有多大？这类低水平复制者预后如何?如果这类人群属于急性感染恢复期，或有自然清除病毒倾向者，那么似无必要作常规PCR定量分析，定期进行PCR定性检测即可。其次，有必要建立一种敏感度介于分子杂交和PCR定量技术之间的检测系统。最近有人利用电化学技术观察到DNA双链互补杂交，甚至单个碱基对结合时发生了微电反应，这给我们以很大启示，今后如有可能在这方面打开突破口，那么基因定量分析两大技术共存的局面会发生转变。但是，在目前这两大技术仍有很强的互补性。
三、HBV突变株定量分析意义的研究。HBV基因突变[15]，尤其是前核基因突变，直接影响HBV感染病情转归及抗毒治疗效果，同时也反映了来自体内或外界选择压力的作用。因此，突变株在体内产生的确切原因，突变株与野生株混合存在的发展趋向，突变株是否为耐药株，突变株与野生株相对含量的变化与致病性的关系，突变株与免疫耐受的关系等均是有必要进一步澄清的问题。
四、基因定量技术在HBV感染流行病学方面的应用[16]。HBV经血液传播致病已十分明确，但是体液传播的问题还必须有充足的证据来补充。体液及其它分泌液或排泄物传播HBV是日常生活密切接后感染HBV的直接原因，但其中必然存在“含量与传染性”的关系，那么这个致病的量值完全可以通过HBV感染流行病学研究得到确证。另外，被污染血制品中HBV基因含量与使用血制品后感染HBV的危险性之间的关系也值得研究。
五、加强HBV低水平复制者预后研究。目前看来，所谓健康携带者或无症状带病毒者、干扰素治疗部分反应者(partial responders),以及其他种种HBV在体内呈低复制状态者，在病情、机体免疫状态、预后等方面可能都有一些特殊性，这类病人是否有自然清除病毒的倾向，是否应当实施抗病毒治疗，是否成为重要的传染源等问题都应该作出符合实际的回答。
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